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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新，是分子生物學(xué)發(fā)展史中的一個(gè)重要里程碑。使用PCR擴(kuò)增技術(shù)，可以將極微量的靶DNA片段特異地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍，大大提高了對(duì)DNA分子的分析和檢測(cè)能力。PCR技術(shù)具有敏感度高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、食品檢驗(yàn)、衛(wèi)生檢驗(yàn)等眾多領(lǐng)域中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。
耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用是PCR技術(shù)的核心。根據(jù)是否具有3’→5’端外切酶活性，耐熱DNA聚合酶通常分為無(wú)校讀活性和有校讀活性兩類。無(wú)校讀活性的DNA聚合酶(以Taq 酶為代表)具有較高的擴(kuò)增效率，但由于缺乏校讀活性，容易發(fā)生堿基錯(cuò)配，故產(chǎn)物中點(diǎn)突變較多。Taq DNA聚合酶還具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，可在PCR產(chǎn)物的3’末端非特異地添加堿基，因單個(gè)A突出堿基的比例zui高，故PCR產(chǎn)物可直接與含有3’末端突出T堿基的載體連接(即TA克隆)，方便PCR產(chǎn)物的克隆、擴(kuò)增和測(cè)序。然而，TaqDNA聚合酶在PCR反應(yīng)*步升溫過(guò)程中即可催化錯(cuò)配引物延伸或引物二聚體形成，因而導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，影響目的片段的合成量。針對(duì)這一現(xiàn)象設(shè)計(jì)的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，在低溫時(shí)其聚合酶活性被抑制，通過(guò)高溫變性，聚合酶的活性恢復(fù)，催化特異性結(jié)合的引物擴(kuò)增，因而提高了目的片段的特異性和產(chǎn)量。另一類有校讀活性的DNA聚合酶(以Pfu為代表)可選擇性地去除錯(cuò)誤摻入的dNTP，維持DNA鏈的正確延伸;然而其擴(kuò)增效率通常低于Taq DNA聚合酶，特別是對(duì)于長(zhǎng)片段DNA鏈的延伸能力較差。基于上述兩類酶的特點(diǎn)，可將適量的Taq DNA聚合酶與任意一種有校讀活性的DNA聚合酶混合，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)緩沖液體系中，可獲得保真性與擴(kuò)增性能介于上述兩類酶之間的混合酶，用于長(zhǎng)片段以及復(fù)雜模板的高保真擴(kuò)增。
PCR實(shí)驗(yàn)受諸多因素的影響。的商業(yè)化耐熱DNA聚合酶及其配套緩沖液通常可以滿足絕大多數(shù)DNA片段擴(kuò)增的需要。首先應(yīng)根據(jù)模板的性質(zhì)(基因組、cDNA、質(zhì)粒等)和目的片段的大小、GC含量、有無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)等，選擇合適的DNA聚合酶(參見GenStar® PCR產(chǎn)品選擇指南)。對(duì)于難于擴(kuò)增的片段，應(yīng)針對(duì)不同的模板、引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，以獲得*的擴(kuò)增效率(詳見“常規(guī)PCR反應(yīng)的優(yōu)化方法)。
A. 模板用量：以50 μl反應(yīng)體系為例
? 人基因組DNA：0.1~1.0 μg
? 大腸桿菌基因組DNA：10~100 ng
? λ DNA：0.5~5 ng
? 質(zhì)粒DNA：0.1~10 ng
B. 引物設(shè)計(jì)原則：
? 引物長(zhǎng)度要滿足特異性需要，一般可在18~25個(gè)堿基之間;擴(kuò)增長(zhǎng)片段時(shí)在24~30個(gè)堿基之間;
? (G+C)%含量應(yīng)盡量控制在40~60%，兩條引物的(G+C)%含量應(yīng)盡量接近;
? 盡量避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)三次以上，3’端應(yīng)避免使用A或T;
? 避免引物內(nèi)部自身配對(duì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu);
? 正反向引物之間應(yīng)避免配對(duì)堿基，尤其是3’端的三個(gè)堿基，否則易生成引物二聚體(Primer dimer);
? 兩條引物的Tm值應(yīng)盡量接近，相差不超過(guò)5oC;
? 引物Tm值的計(jì)算方法：
20 nt以下：Tm = 2x(A + T)+ 4x(G+C)
20 nt以上：Tm = 81.5+0.41x(G+C%)-600/nt(nt：引物的堿基數(shù))
C. 引物用量：
? 0.1~1.0 μM，通常可以0.2 μM起始，根據(jù)體系不同調(diào)整用量;
? 使用簡(jiǎn)并引物、隨機(jī)引物時(shí)，需增加引物總量以彌補(bǔ)產(chǎn)量損失;但隨著引物量加大，特異性將降低;
? 模板較大較多，或結(jié)構(gòu)較復(fù)雜(如人基因組DNA)時(shí)，需減少引物用量以提高特異性;
? 模板較小較少(如質(zhì)粒模板)時(shí)，增加引物用量可提高產(chǎn)量。